近日，中國科學(xué)家利用基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9，對(duì)抑制狗骨骼肌生長的基因（MSTN）進(jìn)行了敲除，培育出兩只肌肉發(fā)達(dá)的“大力神”狗，成功構(gòu)建了世界首個(gè)基因敲除狗模型。

　　科研人員所使用的“基因編輯技術(shù)”，顧名思義，能夠讓人類對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

　　這不是CRISPR/Cas9這項(xiàng)明星技術(shù)第一次得到人們的關(guān)注。在此之前，有著“豪華版”諾獎(jiǎng)之稱的“2015年度生命科學(xué)突破獎(jiǎng)”頒發(fā)給了發(fā)現(xiàn)基因組編輯工具“CRISPR/Cas9”的兩位美女科學(xué)家——珍妮弗?杜德娜和艾曼紐?夏邦杰。二人更是獲得了2015年度化學(xué)領(lǐng)域的引文桂冠獎(jiǎng)——素有諾獎(jiǎng)“風(fēng)向標(biāo)”之稱，曾被認(rèn)為是今年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的最有力競(jìng)爭(zhēng)者。

　　那CRISPR/Cas9到底是一項(xiàng)什么技術(shù)，為何能夠獲得如此這般青睞，又何以在短短兩三年時(shí)間內(nèi)，發(fā)展成為生物學(xué)領(lǐng)域最炙手可熱的研究工具之一，并有近700篇相關(guān)論文發(fā)表？它將來又會(huì)如何影響到我們的生活？

　　CRISPR/Cas9是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）”之后出現(xiàn)的第三代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。與前兩代技術(shù)相比，其成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效的優(yōu)點(diǎn)，讓它迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具。

　　CRISPR/Cas9技術(shù)的靈感來源于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。與哺乳動(dòng)物的二次免疫應(yīng)答類似，細(xì)菌在抵抗病毒或外源質(zhì)粒入侵時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的“記憶”，來抵抗該種外源遺傳物質(zhì)的再次入侵，而這種獲得性免疫正是由細(xì)菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。

　　其中的“間隔序列”來源于病毒或外源質(zhì)粒的一小段DNA，是細(xì)菌對(duì)這些外來入侵者的“記錄”。（如圖A所示）。

　　病毒或外源質(zhì)粒上，存在“原間隔序列”，“間隔序列”正是與它們互相對(duì)應(yīng)。“原間隔序列”的選取并不是隨機(jī)的，這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個(gè)堿基往往都很保守，我們稱為PAM（Protospacer adjacent motifs-原間隔序列臨近基序）。

　　當(dāng)病毒或外源質(zhì)粒DNA首次入侵到細(xì)菌體內(nèi)時(shí)，細(xì)菌會(huì)對(duì)外源DNA潛在的PAM序列進(jìn)行掃描識(shí)別，將臨近PAM的序列作為候選的“原間隔序列”，將其整合到細(xì)菌基因組上CRISPR序列中的兩個(gè)“重復(fù)序列”之間。這就是“間隔序列”產(chǎn)生的過程。

　　當(dāng)外源質(zhì)粒或病毒再次入侵宿主菌時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)CRISPR序列的表達(dá)。同時(shí)，在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因，稱為Cas基因。CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CRISPR RNA和Cas基因的表達(dá)產(chǎn)物等一起合作，通過對(duì)PAM序列的識(shí)別，以及“間隔序列”與外源DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)，來找到外源DNA上的靶序列，并對(duì)其切割，降解外源DNA。這也就實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒或外源質(zhì)粒再次入侵的免疫應(yīng)答。

　　正是基于細(xì)菌的這種后天免疫防御機(jī)制，CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，從而使科學(xué)家們利用RNA引導(dǎo)Cas9核酸酶實(shí)現(xiàn)對(duì)多種細(xì)胞基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾。

　　在CRISPR/Cas9技術(shù)中，我們把即將被編輯的細(xì)胞基因組DNA看作病毒或外源DNA?；蚓庉嫷膶?shí)現(xiàn)只需要兩個(gè)工具——向?qū)NA（guide RNA, gRNA）和Cas9蛋白。

　　其中，向?qū)NA的設(shè)計(jì)并不是隨機(jī)的，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（即三堿基序列NGG，其中N可以是任意堿基），而且向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。以基因敲除為例，如圖3所示，在待敲除基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)NA(向?qū)NA1，向?qū)NA2)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，向?qū)NA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。

　　對(duì)于DNA雙鏈的斷裂這一生物事件，生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。

　　而DNA片斷的插入或定點(diǎn)突變的實(shí)現(xiàn)，只需在此基礎(chǔ)上為細(xì)胞提供一個(gè)修復(fù)的模板質(zhì)粒，這樣細(xì)胞就會(huì)按照提供的模板在修復(fù)過程中引入片段插入或定點(diǎn)突變，對(duì)受精卵細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，并將其導(dǎo)入母體中，可以實(shí)現(xiàn)基因編輯動(dòng)物模型的構(gòu)建。

　　當(dāng)然，CRISPR/Cas9技術(shù)的成功率并非百分之百。向?qū)NA靶向序列的非特異性，以及DNA損傷修復(fù)的不確定性，都可能會(huì)導(dǎo)致基因組上其它位置產(chǎn)生未知的突變，也就是所謂的“脫靶”現(xiàn)象，這也是現(xiàn)階段影響CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的瓶頸之一。但隨著科研人員不斷對(duì)Cas9蛋白的優(yōu)化改造，對(duì)靶基因識(shí)別特異性的增強(qiáng)， CRISPR/Cas9技術(shù)的“打靶”效率將不斷提高。

　　CRISPR/Cas9技術(shù)在醫(yī)療健康、生產(chǎn)生活、家畜育種等領(lǐng)域的應(yīng)用，不斷取得喜人的新成果。

　　如在醫(yī)療健康領(lǐng)域，用iPS細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）治療人類的鐮刀形貧血癥，可以將病人的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，利用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)同源重組來修復(fù)發(fā)生突變的血紅蛋白基因，再將修復(fù)的iPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞移植到病人體內(nèi)。此外，像使用CRISPR技術(shù)根除HIV病毒、誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞自我毀滅、kaiyun全站網(wǎng)頁版登錄構(gòu)建癌癥模型等最新成果先后被Nature等著名雜志所報(bào)道。在奶制品的發(fā)酵中，利用CRISPR/Cas9增強(qiáng)發(fā)酵菌株對(duì)噬菌體的防御能力；在家畜育種方面，也正在利用基因編輯工具通過對(duì)顯著影響家畜生產(chǎn)性能的基因位點(diǎn)進(jìn)行改良，以實(shí)現(xiàn)豬、牛、羊等大型家畜生產(chǎn)性能的提高等。

　　但正如科學(xué)是把雙刃劍，任何新技術(shù)的出現(xiàn)都少不了其反對(duì)者的存在，在CRISPR/Cas9技術(shù)得到熱烈呼聲的同時(shí)，不少人也對(duì)它提出了質(zhì)疑，特別是對(duì)其脫靶事件可能導(dǎo)致基因組其他位置產(chǎn)生未知突變表示擔(dān)憂。

　　作為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，筆者認(rèn)為CRISPR/Cas9的創(chuàng)新性、技術(shù)性毋庸置疑，隨著對(duì)CRISPR系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的加深，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化改造，相信其打靶效率會(huì)進(jìn)一步提高，CRISPR/Cas9以及其衍生技術(shù)終究會(huì)帶來一場(chǎng)科學(xué)史上的巨大變革。期待在不久的將來，CRISPR/Cas9所帶來的巨大轉(zhuǎn)變必將能夠惠澤萬家，到時(shí)候?qū)儆谒闹Z獎(jiǎng)終將到來。

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